Immediate Moderate Intensity Treadmill Exercise After Restraint Stress Induced ERK-mediated Anxiety and Depression

연구대상

본 연구에 사용된 6주령의 Rat은 대한바이오링크 (Daehan Biolink Inc, Korea)에서 구입하여 12시간의 주 ∙ 야간주기 (주간주기, 오전 8시–오후 8시), 온도 23°C ± 2°C 습도 50%에서 사육하였다. 실험기간 동안 항균 처리된 사료(Purina Mills, Korea)와 수분섭취는 제한 없이 공급하였으며, 실험의 모든 동물의 처치는 corticosterone 농도의 주간 변화에 의해 발생하는 실험의 불일치를 막기 위해 오전 9시에서 오후 2시 사이에 진행하였다. 모든 실험은 Korean Academy of Medical Science(KAMS)의 권장사항에 따라 진행하였다.

실험설계 및 절차

트레드밀 운동과 감금스트레스 효과를 조사하기 위하여 집단은 대조군 그룹(CT), 감금스트레스 그룹(RS), 감금 스트레스 후 트레드밀 운동 그룹(EX)으로 각 15마리씩 구분하였다. RS그룹은 투명 아크릴로 구성된 restrainer(지름 5 cm x 길이 20 cm)에 rat을 최소한의 핸들링을 통해 넣고 restrainer 선단에서 큰 호흡 구멍을 통하여 충분히 환기를 제공하였다. 앞 뒤 상 하의 움직임을 제한하여 하루 1시간씩 7일 동안 적용하였다. EX그룹은 감금스트레스 적용 1시간 뒤 즉시 트레드밀을 이용한 지구성 운동을 실시하였다. 운동 강도는 경사도를 0%로 고정시킨 상태에서 30분 동안 13 m/min의 중강도 운동으로 7일간 실시하였다(Kim, 2008). 운동 시 뇌신경 변화에 영향을 주는 스트레스를 최소화하기 위해 전기 자극은 사용하지 않으며, 매일 감금 스트레스 전 몸무게를 측정하였다. 행동검사는 감금스트레스 직후와, 감금스트레스 후 트레드밀 운동 직후에 실시하였다(Figure 1).

Figure 1.

Time schedule of the Animal handling and behavior test

Free Moving Test

불투명 벽(35 cm)으로 둘러싸인 개방영역(80 x 80 cm)에 CT, RS, EX 실험군 rat을 즉시 넣고 10분 동안 행동을 video camera로 촬영하였으며, 촬영된 영상은 실시간으로 EthoVision system(Noldus 11.5ver, Netherlands)과 연동하여 1분 간격으로 rat의 이동속력을 측정하고 10분 동안 rat의 freezing 된 시간을 분석하였다. 테스트를 마친 뒤 개방영역은 70 %의 에틸알코올로 세척한 뒤 다음 실험군 테스트를 진행하였다.

Open Field Test

대조군 및 감금스트레스와 트레드밀 운동을 7일째 수행한 Rat을 움직이기 충분한 사각형 모양의 개방된 상자(80 x 80 x 35 cm)의 중심에 올려놓고 10분 동안 환경을 탐구하게 하였으며 실험동물의 일반운동 활성을 측정하기 위해 EthoVision system을 활용하여 rat의 이동 경로를 추적하고 필드 중앙의 60 x 60 cm 영역을 중심부(central zone)로 설정한 뒤 중심부의 이동횟수, 이동거리, 속도를 분석하였다. 스트레스 자극 또는 트레드밀 운동 직후에 행동검사를 실시하였다.

Western Blot Analysis

행동실험을 마친 rat의 뇌에서 해마를 적출 한 후 ERK 단백질의 인산화 정도를 분석하였다. 적출 된 해마를 PBS로 3회 세척 후, Lysis buffer(50 mM Tris HCl pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2.5 mM EDTA pH8.0)에 넣고 초음파 분쇄기로 30초간 분쇄 후 15분간 얼음에 유지한 뒤 4°C에서 1000 g로 10분간 원심 분리하여 crude brain fraction을 분리하고 bradford assay를 통하여 20μg씩 10% SDS-Polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. PVDF membrane으로 단백질을 전이시킨 후, 5% Skim milk가 첨가된 1×TBST 용액으로 30분 동안 실온에서 blocking시킨 후, p-ERK Thr177/Thr160 (cell signaling, 1:1000), ERK(Santa Cruz, 1:1000), β-actin (abcam, 1:4000) 항체를 이용하여 4에서 8시간 탐침 하였다. 이후 TBST 완충액으로 10분간 5회 세척 후 각 항체에 따른 2차 항체인 Mouse-HRP(Santa Cruz, 1:5000), Rabbit-HRP(Santa Cruz, 1:5000)를 상온에서 1시간 동안 반응 후 TBST로 1시간동안 4회 membrane을 세척하였다. Enhanced Chemiluminescence (ECL) (Biosesang, Korea) 반응을 유도 한 후 CHemiDoc (Bio-Red, USA)을 사용하여 이에 반응하는 단백질의 밴드를 분석하였다.

자료처리

본 연구에서 도출된 모든 측정 자료는 PC / SPSS(Version 20.0) 프로그램을 이용하였다. 기술 통계학적 분석을 통해 측정된 각 집단의 평균 및 표준오차를 기술하고 각 그룹 간 비교를 위해 대응표본 T-test를 실시하였으며 통계적 유의수준은 p<.05로 설정하였다.

집단 간의 체중 변화

감금 스트레스 자극과 트레드밀 운동을 실시한 5일 동안 각 그룹의 체중 변화를 측정하였다(Figure 2). 체중은 스트레스 처치 및 운동 실시 1일째부터 5일까지 모든 그룹에서 고르게 증가하였으며 그룹 간 유의한 차이점을 보이지 않아 단기간의 감금스트레스 및 중강도 운동은 실험동물의 체중에는 영향이 없는 것으로 나타났다.

Figure 2.

Analysis of weight change among each group

급성스트레스 직후 중강도 운동에 의한 운동활동 감소

각 그룹간 공포의 정서 변화를 반영하는 행동분석을 위하여 각 그룹간 Free moving test를 실행 하였다(figure 3). 행동검사 1분후에는 세 그룹 간 유의한 차이를 보이지 않았으나 2분경과 후부터 EX그룹의 이동속도가 CT그룹에 비하여 82% 까지 유의하게 낮아지고 4분후에 최대 84%까지 낮아졌으며 RS그룹에 비하여 69% 까지 유의하게 낮았으며 그 차이가 유지되었다(p<.01) (Figure 3A).

Figure 3.

Analysis of free moving test. Velocity (A), Distance (B), Freezing times (C).

각 그룹의 이동거리를 나타낸 분석 결과는 CT그룹이 EX그룹보다 실험시작 후 1-2분 사이에 최대 85% 많이 이동하였고 그 뒤로 10분까지 유의하게 많이 이동하였으며(p<.05), STRESS그룹보다 1분에서 2분 사이에 20% 유의하게 많이 이동한 것으로 나타났다(p<.01). EX그룹의 이동거리가 2분후부터 급격히 떨어져 2-4 cm/sec로 유지되었다(Figure 3B). Figure 3C는 각 그룹 실험군의 Freezing 시간을 측정한 것이다. CT그룹 보다 RS그룹의 Freezing 시간이 83%로 유의 하게 높았고 (p<.05), EX그룹은 RS그룹 81% (p<.05), CT그룹보다 164% (p<.01) 유의 하게 늘어났다.

급성스트레스 직후 중강도 운동에 의한 정서 상태 변화

Open Filed Test를 통하여 CT, RS, EX그룹의 중심부(Central Zone) 내로의 이동횟수, 거리, 속도를 분석하였다(figure 4). (Figure 4B)는 중심부 내로의 이동횟수 나타내며 RS그룹은 CT그룹 45.3% 유의하게 낮았으며(p<.05). EX그룹은 CT그룹보다 70.3% 유의하게 낮았으나 RS그룹과는 유의한 차이를 보이지 않았다. 중심부에서 그룹간에 이동거리 분석에서 RS그룹은 CT그룹보다 중심부에서 이동한 거리가 43% 유의하게 낮은 활동량을 보였다(p<.05). EX그룹은 RS그룹보다 중심부에서 이동한 거리가 35% 유의하게 낮은 활동량을 보였다(p<.05) (Figure 4C). 중심부 내에서의 평균 이동속도 분석결과 EX그룹은 CT그룹과 71%, RS그룹보다 63%의 유의하게 낮은 평균 이동속도를 보였다(p<.01) (Figure 4D).

Figure 4.

Analysis of center zone movement on open field test. Moving route(A), number of entrances (B), Distance (C), Velocity (D).

뇌의 해마에서 ERK의 인산화 변화

행동분석 종료 후 각 그룹의 뇌에서 해마를 적출하여 western blot을 통해 CT그룹, RS그룹과 EX그룹간의 pERK thr177/thr160 의 phosphorylation 정도를 비교 분석하였다. ERK phosphorylation이 CT그룹에 비해 RS그룹이 165% 유의하게 높았으며( p<.01) EX그룹은 CT그룹보다 292% 높게 나타났다(p<.01).

Figure 5.

Phosphorylation of pERK thr177/thr160 in brain hippocampus.